Pewarnaan Gram

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsiatnupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.

            Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi guna pencirian don identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu karena bnkteri tersebut mengiknt kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna  merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif don Gram negatif.

            Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi yang soma.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus (bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui  jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

 Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

            Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan differensial digunakan untuk bakteri.

         Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)

         Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap, maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan, yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan (bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (violet kristal)

Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

2. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

3.  Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin, tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu :

1.  Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )

Meliputi : dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula penyimpanan.

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)

Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospora

   Sthaplyococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola.  Bakteri ini ada  yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna kuning dan sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik yang dimiliki sthapylococcus aureus diantaranya hemolytic pada darah segar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh paa suhu erkisar antara 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase.  Selin itu, biasanya s. aeureus merupakan pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran darah (kenneath, 2008)

   Menurut kenneath (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteraceae yang termasuk gram negative dan berbentuk batangyang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membatu sistem pencernaan manusia dan melindunginya  darbakteri pantogen, akn tetap pada strain baru dari e. coli merupakan pathogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic ( hus). Peranan yanag menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indicator pada percemaraan air serta mendeteksi patoge pada feses manusia yang disebabkan oleh salmonella typi.( mikrolibrary, 2008). Endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress dan kurang nutrisi, yang memiliki kemunginan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi menjadi baik  (ncbi, 2008).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

-  Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan     terdapat   didalam

- lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

-   Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

-   Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

-   Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

-   Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

-   Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

-   Peka terhadap streptomisin

-   Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

-    Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

-   Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

-          Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

-          Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

-          Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

-           Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

-          Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

-          Tidak peka terhadap streptomisin

-          Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:

1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)

Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan

2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)

Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Pewarnaan gram:

a.Bakteri gram positif

            Bakteri ini mengandung peptidoglikan yang tebal dan banyak asam teikoik yang saling berikatan silang sehingga bakteri ini akan tahan terhadap dekolorisasi oleh alcohol(menyerap warna dasar yaitu kristal violet).Bakteri akan bewarna ungu.

b.Bakteri gram negatif

            Bakteri yang mengandung lapisan peptidoglikan yang tipis.Bakteri membiarkan warna kristal violet tercuci dengan zat dekolorisasi seperti alcohol atau aseton.Bakteri akan bewarna merah/pink.

Pewarnaan gram menggunakan 4 macam zat warna yaitu:

1.Kristal violet

Zat warna primer ini digunakan pada tahap pertama dan akan mewarnai semua sel bakteri menjadi warana ungu.

2.Lugol(larutan mordan)

Reagen ini berguna sebagi mordan,yaitu suatu substansi yang akan meningkatkan afinitas sel bakteri terhadap zat warna dengan cara berikatan dengan zat warna primer sehingga membentuk kompleks yang tidak larut.

3.Alkohol

Reagen ini merupakan reagen dekolorisasi.Kerja reagen ini ditentukan oleh konsentrasi lipid dan ketebalan lapisa peptidoglikan pada dinding sel bakteri.Pada bakteri gram negative,alcohol akan melarutkan lipid pada lapisan luar dinding sel.Dan karena lapisan peptidoglikan dinding sel bakteri gram negative tipis, maka kompleks kristal/gentian violet dengan lugol akan mudah terlepas sehingga sel bakteri gram negative menjadi tidak bewarna kembali.Pada bakteri gram positive,lapisan peptidoglikannya lebih tebal sehingga kompleks zat warna primer + lugolakan sulit terlepas dan sel bakteri akan tetap bewarna ungu.

4.Air fuchsin atau safranin sebagai counterstain

Zat warna ini akan mewarnai sel bakteri yang sudah tidak bewarna akibat proses dekolorisasi tadi menjadi terwarna merah.Karena hanya sel bakteri gram negative yang mengalami dekolorisasi,maka golongan bakteri ini akan mengabsorbsi counterstain ini sedangkan sel bakteri gram positive akan tetap bewarna ungu(sesuai zat primer).

           

METODE PENELITIAN

1.Waktu dan Tempat

Praktikum”PEWARNAAN GRAM”dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas RIAU pada hari selasa 30 Juni 2009 pukul 09.00-14.30 WIB.

2. Cara Kerja

-Pertama-tama mempersiapkan bahan dan alat terlebih dahulu yaitu:

a.Alat              :kaca objek,pena/spidol permanen,jarum ose,mikroskop

b.Bahan           :Biakan bakteri E.Coli dan S.Aureus

                        · Pewarna dasar : kristal violet

· Larutan pengikat warna dasar: Larutan Iodin

· Larutan pencuci warna dasar : Alkohol

· Pewarna pembanding            : Lar. Safranin

-Lalu,bersihkan dua buah kaca objek untuk tempat masing-masing bakteri

-Setelah bersih,keringkan.Apabila sudah kering,beri tanda lingkaran ditengah kedua kaca objek

-Tetesi aquades didalam area lingkaran tersebut

-Lalu ambil masing-masing bakteri dari tempat biakannya dengan menggunakan jarum ose yang telah dipanaskan

-Setelah diambil,oleskan pada aquades yang terdapat pada masing-masin kaca objek

- Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik

-cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan

-teteskan larutan iodin, biarkan selama 30 detik

-cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan

-rendam atau basuh dengan alkohol selama 30 detik

-teteskan larutan safranin, biarkan selama 30 detik

-cuci dengan air mengalir, lalu keringkan

-amati dengan mikroskop

-gambar bentuk morfologi

HASIL DAN PEMBAHASAN

1.Staphylococcus aureus(400 x)

Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri gram positif. Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel mencapai 1 µm, dan koloninya seperti buah anggur.

Klasifikasi Staphylococcus (Rosenbach. 1884):

Kingdom : Bacteria

Phylum : Firmicutes

Class : Cocci

Order : Bacillales

Family : Staphylococcaceae

Genus : Staphylococcus

2.Escherichia coli (1000 x)

Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang pendek. Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun seperti rantai memanjang.Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen.

Klasifikasi E. Coli (Migula. 1895):

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Class : Gamma Proteobacteria

Order : Enterobacteriales

Family : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Species : E. coli